Larry Daley (Ben Stiller), były stróż z nowojorskiego Muzeum Historii Naturalnej, jest właścicielem firmy produkującej przedmioty domowego użytku. Pewnego dnia dowiaduje się, że eksponaty z jego byłego miejsca zatrudnienia uznane zostały za przestarzałe i mają trafić do magazynów Instytutu Smithsona w Waszyngtonie. Nie zastanawiając się długo, jedzie do stolicy, aby ocalić dobrze znane sobie postacie Rzymianina Octaviusa (Steve Coogan) i kowboja Jedediaha (Owen Wilson). Na miejscu Larry natrafia jednak na kłopoty, władzę na muzeum przejął bowiem wybudzony z trwającego trzy tysiące lat snu egipski władca Kahmunrah (Hank Azaria), któremu pomagają Iwan Groźny (Christopher Guest), Napoleon Bonaparte (Alain Chabat) i Al Capone (Jon Bernthal). Niespodziewanie Daley znajduje sojuszników wśród innych ożywionych eksponatów muzeum. Po jego stronie stają m.in. George Armstrong Custer (Bill Hader), Theodore Roosevelt (Robin Williams) i Amelia Earhart (Amy Adams).